1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
棉花是全球最重要的经济作物之一，它为纤维纺织工业提供40%的原材料。但是棉花生产受棉花黄萎病的危害，在我国各棉区爆发成灾，已成为我国自枯萎病得到有效控制之后棉花生产上的第一大病害，是棉花可持续生产的主要障碍之一[1]。棉花黄萎病在棉花整个生育期均可发病，发病后会造成棉花叶片失绿变黄，萎蔫脱落，严重时造成植株死亡，造成产量减少，品质下降。棉花黄萎病病原菌寄主范围广，可以通过土壤、种子、农具甚至水传播扩散，环境和寄主变化容易诱发而形成新的生理型，目前尚无有效的化学防治方法，且陆地棉普遍缺乏抗原基因。因此，棉花黄萎病抗性基因的发掘及其遗传育种研究面临极大挑战，进展也十分缓慢。
为了研究棉花与黄萎病菌互作机制，完善抗病过程的分子调控网络的和挖掘参与对抵御黄萎病的具有调控作用的基因来培育抗病品种，近些年来生物测序和生物信息学方法越来越多的被运用到棉花抗黄萎病研究当中。运用生物信息学和转录组测序技术从二倍体雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）中发现了抗病基因类似物（resistance gene analogues, RGAs）和棉花黄萎病菌的反应位点（Verticillium dahliae response loci, Vd RLs），其对抵御黄萎病菌有重要作用[2]。
在研究植病互作的同时，一些围绕抗性基因克隆以及功能验证的工作也被开展。特别是近年来发展起来的病毒介导的基因沉默技术（VIGS，Virus induced gene silencing），无需转化，无需获得稳定遗传转基因植物，在侵染植株本身就可以初步鉴定靶基因的功能。VIGS一经建立，即被视为研究植物基因功能的强有力工具，得到了深入的研究和广泛应用。棉花已经成功建立了VIGS技术体系，应用该技术，已经初步筛选鉴定了一些与黄萎病抗性相关的基因。用VIGS方法沉默海岛棉GbRVd基因后与对照相比更感病，干涉棉株的水杨酸含量减少且伴随活性氧产生[3]。抑制海岛棉植株中与番茄抗黄萎病基因Ve1有较高同源度的Gbvdr3基因的表达，接种大丽轮枝菌后植株抗性降低。该基因在拟南芥植株中超量表达对黄萎病菌抗性提高，同时抗病相关基因PR1、PDF1.2等在转录水平表达量提高，次生代谢物质胼胝质增多，活性氧积累[4]。在棉花、拟南芥中超量表达类受体蛋白基因GbRLK，能够提高其抗黄萎病菌的能力[5]。除此之外利用VIGS体系还鉴定GhBAK1 [6]、GhMLP28[7]、GhDHS1[8]、GbNRX1[9]、GhMYB108[10]等基因也参与到了抵御黄萎病菌过程中。将抗黄萎病菌基因进行克隆与验证，对抗病育种具有着积极作用。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究的目标、内容和拟解决的关键问题
1.1 研究目标
采用VIGS技术初步鉴定GhCRK26和GhCRK29的功能
3. 研究的方法与方案
2.研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
2.1 研究方法
① 高效的VIGS-TRV技术。烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)诱导的基因沉默 (TRV- VIGS)，以其沉默效率高、持续时间长，寄主植物病毒症状轻，不会掩盖沉默表型，且在各种组织均可产生基因沉默等优点，成为目前应用最为广泛的一类基因沉默体系。本实验室已经成功运用该技术鉴定了多个黄萎病、非生物胁迫抗性基因。
4. 研究创新点
3.特色或创新之处
①在以往对棉花抗黄萎病相关基因的研究中，通常把海7124作为抗病品种，从中鉴定、克隆抗性基因。然而，海7124等所谓抗黄萎病品种对黄萎病抗性不高，或只能耐受少数的生理类型，所以很难筛选到抗性基因。本研究选用对大丽轮枝菌高感的TM-1为实验材料，从棉花感病机制中去发掘与棉花黄萎病抗性相关的基因，为研究黄萎病抗性分子机制开辟新的思路。
②本实验成功克隆了前期实验室筛选的GhCRK26、GhCRK29基因，结合VIGS基因沉默技术通过发病率病情指数统计、体视镜观察、真菌恢复试验等方式，以及沉默植株抗病相关基因的实时PCR的方法，对基因的功能进行了初步验证。
5. 研究计划与进展
1．对候选基因进行生物信息学分析，设计VIGS干扰片段引物。（2018年7—8月）
2．沉默载体的构建及其转化；对沉默植株及对照分别接种大丽轮枝菌，进行黄萎病抗性鉴定（2018年9月—2018年11月）
3．进行重复试验，结合体视镜观察、真菌恢复试验等方式对基因功能初步验证（2018年11月—2019年3月）
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