1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
棉花是一种重要的经济作物，黄萎病和多种环境胁迫是棉花可持续生产的主要障碍。以大丽轮枝菌为病原菌的棉花黄萎病是最具破坏性的生物胁迫，其防治难度大，传统的防治方法无法有效治理。近年来随着基因组学的发展，通过深入研究植物抗病的分子机制，利用植物基因工程能更好地实现抗病品种的选育。目前的研究已经初步筛选鉴定了一些与黄萎病抗性相关的基因。通过对棉树种质进行全基因组关联研究（GWAS），对幼苗接种大丽轮枝菌，鉴定出谷胱甘肽S-转移酶基因GaGSTF9可通过水杨酸（SA）相关信号通路响应大丽轮枝菌的入侵。[1]在另一项研究中，观察到核糖体蛋白GaRPL18的表达受到大丽轮枝菌侵染的诱导，SA处理使GaRPL18上调表达。通过病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）鉴定其表达水平与棉花抗性的关系，沉默植株相比对照对大丽轮枝菌的抗性提高，推测该基因在抗病方面起重要作用[2]。而在棉花中过表达类GbRLK基因，被发现能够提高其抵御黄萎病的能力[3]。
在对植物免疫和生长发育调节过程的研究中，泛素化途径引起了研究人员的注意。泛素化是真核生物中蛋白质的主要翻译后修饰机制之一，该过程涉及三种酶的协同催化活性：E1泛素化激活酶，E2泛素化结合酶和E3泛素连接酶[4]。在这三种酶中，E3泛素连接酶是泛素化途径中最多样化的组分。E3泛素连接酶依据作用机制和结构域的不同可以分为：HECT（Homologous to E6-AP COOH-Terminus），RING（ReallyInteresting New Gene）和U-box[5]。U-box蛋白广泛存在于真核生物，植物的U-box（PUB）蛋白属于E3泛素连接酶家族。除了对拟南芥和水稻的PUB基因有所研究外，目前还通过全基因组分析了莱茵衣藻和白菜的PUB基因[6，7]。PUB蛋白已被证明在激素信号传导[8]，种子萌发[9]，抵御病害[10]等方面起重要的调节作用。
在植物抗病方面，许多PUB（植物U-Box）E3连接酶被报道为植物免疫的正向或负向调节剂。E3连接酶SPL11负调节病原体相关分子模式（PAMP）触发的信号传导和免疫反应[11]。PUB22通过靶向外排复合体Exo70B2的亚基来负调节免疫反应，用于蛋白酶体降解[12]。与上述负调节因子相反，U-box E3泛素连接CMPG1/ AtPUB20[13]和拟南芥AtPUB17[10]及其在烟草中的功能性直向同源物NtACRE276，马铃薯StPUB17基因被证明是植物抗病性的正调节剂。马铃薯PUB17基因（StPUB17）首次通过对接种马铃薯致病疫霉后转录变化的抑制消减杂交分析进行鉴定，发现其在感染过程中迅速上调[14]，初步研究表明，StPUB17-RNAi马铃薯植株对致病疫霉的敏感性增强，表明它可能与致病疫霉抗性相关。E3泛素连接酶PUB17是番茄中抗性蛋白CF4/9触发的程序性细胞死亡（PCD）的正调节因子，它们是 Cf9和Cf4受体蛋白对Avr9和Avr4肽产生免疫反应所必须的调节因子[15]。生物信息学分析显示拟南芥AtPUB17和烟草NtPUB17是最接近的同源物。在NtPUB17-Cf-9烟草植物的沉默系中AtPUB17的瞬时表达可以恢复叶霉菌Avr9触发的过敏反应（HR），而在突变体PUB17缺乏E3连接酶的活性时没有此现象。此外，由NB-LRR抗性蛋白RPM1和RPS4介导的过敏反应也需要AtPUB17[10]。综上研究显示，烟草ACRE276及其功能同源物AtPUB17编码具有ARMADILLO（ARM）重复结构域的U-box蛋白，E3泛素连接酶是植物抗病性的关键正调节因子。环境胁迫也是导致作物的产量下降的因素之一。阐明干旱胁迫的植物分子机制和耐旱作物的发育对于粮食安全至关重要。最近的研究表明，PUBE3泛素连接酶是植物激素ABA介导反应的负调节因子[16]，而ABA是调节干旱胁迫响应的主要调节剂，能通过诱导气孔关闭以减轻蒸腾水分流失并激活各种下游基因以启动防御。在拟南芥中，AtPUB44/ SAUL1 E3泛素连接酶通过下调ABA水平来防止叶子的过早衰老。与抑制浓度的ABA的野生型（WT）相比，Atpub43突变体显示出种子发芽率增加[9]。此外，AtPUB22和AtPUB23也被证实是干旱胁迫反应的负调节因子，但它们的基因表达不受ABA的影响[16]。上述证据表明PUB蛋白在植物对非生物胁迫的响应中起重要作用。
2. 研究的基本内容和问题
1.1 研究目标
① 克隆棉花GhPUB19基因。
② 利用实时荧光定量PCR分析GhPUB19基因在陆地棉TM-1的根、茎、叶、胚珠等不同组织器官以及经过非生物胁迫和激素等处理的陆地棉TM-1的幼苗中转录水平。
3. 研究的方法与方案
2.1 研究方法
① 常规的PCR体系扩增目标基因。
② 实时荧光定量PCR。采用CTAB法提取棉花和拟南芥叶片基因组DNA。分别以GhActin9和AtUBQ10作为棉花和拟南芥的内参基因为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测棉花中沉默后目的基因的表达，以及GhPUB19在转基因拟南芥中的表达。
4. 研究创新点
① 克隆棉花GhPUB19基因并进行生物信息学分析与表达模式分析。
② 利用VIGS结合大丽轮枝菌接种实验鉴定GhPUB19与棉花大丽轮枝菌抗性的相关性，并通过GhPUB19过表达拟南芥进一步分析该基因在棉花抗逆中的功能。
5. 研究计划与进展
对GhPUB19进行生物信息学分析并进行表达模式分析，设计VIGS干扰片段引物（2018年6月）
沉默载体的构建及其转化棉株，过表达载体的构建并转化拟南芥（2018年7月—2018年8月）
对沉默植株及对照分别接种大丽轮枝菌，进行黄萎病抗性鉴定。（2018年9月）
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