大豆叶片异黄酮的提取测定及分析开题报告

课题的意义、国内外研究进展、应用前景等（列出主要参考文献）

概述:大豆是世界上重要的经济作物之一，不仅能提供大量的蛋白质与油脂，在生长过程中还能产生一种对人类健康非常有益的次生代谢产物 － 大豆异黄酮( soybean isoflavone，ISO)。大豆异黄酮是多酮类混合物，是一种生物活性物质。由于是从植物中提取，与雌激素有相似结构，因此大豆异黄酮又称植物雌激素。其广泛存在于豆类、谷类、水果、蔬菜等300多种植物中。随着大豆异黄酮研究的不断地突破，近年来国内外众多研究表明 ,大豆异黄酮具有预防癌症 、防止骨质疏松和防止心血管疾病、抗炎、抗菌、抗衰老、抗氧化及防止酒精中毒等功效，这些发现使得大豆异黄酮在医药与食品保健领域的地位越来越高。在发达国家，以异黄酮为主要成分的保健品已经非常普遍。但是在国内外的众多研究中，对于大豆异黄酮与植物的抗性关系研究尚浅，本实验主要针对此问题做一定探索。

含量及分布:大豆异黄酮主要存在于豆科植物中，其中在大豆中含量最高。不同植物中的大豆异黄酮含量不同，同种植株不同部位的含量也不相同。孙君明等(1998)^[1]研究认为氮肥对大豆籽粒异黄酮含量有影响, 影响规律具有品种间差异。Yin等(2005)^[2]认为土壤中的钾素含量对大豆籽粒异黄酮含量有影响。可见, 肥料对大豆异黄酮含量有所影响。董李平(2004)通过研究大豆结实前的4个生长时期的异黄酮在组织中的含量与分布,以探讨大豆结实前异黄酮的积累规律。结果表明,在大豆出苗期地上部分(主要是子叶)的异黄酮含量远高于地下部分;幼苗期子叶中异黄酮的含量低于出苗期异黄酮地上部分(主要是子叶),而真叶、茎和根中都出现了异黄酮;V3期和R2 期,叶片中异黄酮含量进一步增加,其含量远高于茎和根。对大豆叶片中大豆异黄酮含量的积累规律深入了解必将对大豆异黄酮代谢规律研究提供理论依据。前人研究^[3]认为影响大豆异黄酮含量的限制因子是底物含量水平,在大豆初花期由于需要合成花青素等苯丙氨酸途径的产物 ,可能是由于此原因激活了该代谢途径,从而使底物水平提高,进而增加了异黄酮的合成。张大勇等^[4]研究发现大豆叶片中大豆黄素 、染料木素含量及异黄酮总含量在初花期(R1)有一个峰值, 并且营养胁迫对大豆黄素含量 、染料木素含量及异黄酮总含量及 3种苷元组分含量有促进提高的作用。

提取与测定方法:大豆异黄酮属于大豆生长过程中的一种次生代谢产物，在大豆籽粒中的含量很少，高异黄酮品种异黄酮含量也不过 6.0 μg·mg－1左右^[5]，并且异黄酮提取不易，提取成本相对较高，所以建立一种高效的实验室提取、检测方法是大豆异黄酮新品种选育、异黄酮研发工作的必要前提。目前,大豆异黄酮的测定方法主要有高效液相色谱法和毛细管电泳法(CE)。高效液相色谱法( HPLC) 是目前试验研究工作中应用最广泛的一种检测方法，能够快速、准确地分离、测定异黄酮各组分含量^[6]。研究者们对HPLC 应用于大豆异黄酮的测定进行了很多优化研究，但使用的提取方法、仪器以及外界条件各异，以致异黄酮提取效率、检测结果均有不同，说明优

化的HPLC法还不够完善。李雪莹等人^[7]在此基础上，建立了高效、快速、准确测定大豆异黄酮总量和各组分含量的高效液相色谱法( HPLC) 标准体系，经试验验证，优化后的高效液相色谱仪精度良好、测量体系重现性较好，标准偏差均在 2% 以内;异黄酮 6 种成分加样回收率高，均接近 100% 。优化的 HPLC 可以满足实验室内日常检验需要，异黄酮各组分的提取与测定效果良好。目前大豆异黄酮主要实验室提取方法是醇 －水提取法，此方法操作简单，对仪器与试剂要求较低，虽然提取时间稍长，但提取操作简单，消耗能源少，提取得到的异黄酮产物稳定性好，缺点是后续纯化处理比较繁琐。

分析方法:目前，通过将各种色谱分离方法与紫外检测器，质谱（MS）或串联质谱分析（MS / MS）相结合，大力开发异黄酮分析方法。在这些技术中，根据保留时间特性，碎片模式和同量异位物种之间的区别，UPLC / MS已被证明是异黄酮分析的最有效工具。Shuang等^[8]提供了一种新的，简单可靠的方法，基于超高效液相色谱结合光电二极管阵列检测器和电喷雾电离质谱（UPLC-PDA-ESI-MS），通过正模式UPLC-ESI-MS同时鉴定和定量异黄酮及其位置异构体。 国内外学者对大豆异黄酮及其组分含量进行了遗传分析和初步QTL定位研究。对于推动采用分子标记辅助育种手段选育高异黄酮含量的大豆品种, 具有十分重要的的现实意义。Liang等^[9]对大豆异黄酮及其组分含量的配合力和杂种优势以及大豆籽粒异黄酮遗传效应和基因定位研究发现, 大豆鼓粒成熟期较低的均温和较大的昼夜温差有利于异黄酮的积累; 在出苗期较多的日照和较低的均温有利于异黄酮的形成。异黄酮含量和黄豆苷元既受加性效应又受非加性效应的控制, 染料木苷主要受非加性效应控制, 染料木素、大豆苷元和大豆苷这3个成分的遗传主要受加性效应控制。大豆异黄酮主要受制于母体遗传效应, 其次为胚基因效应, 细胞质效应影响较小^[10]。不同遗传体系的异黄酮基因主效应明显大于环境互作效应。植物异黄酮生物合成途径中的关键酶包括苯丙氨酸解氨酶(PAL )、查尔酮合酶(CHS )、查尔酮异构酶(CHI )、异黄酮合酶(IFS )。这些酶能够在转录水平对异黄酮的生物合成进行调控。异黄酮合酶是在苯丙素合成途径的一条支路中,催化大豆异黄酮合成步骤的第一个酶。

研究目标:目前仅鉴定出大豆异黄酮合成相关基因，尚未定位到有关叶片异黄酮含量的基因，叶片中是否存在其它特异调控异黄酮含量的基因尚不明确，因此我们拟使用栽培大豆自然群体，优化叶片异黄酮含量测定方法，了解叶片异黄酮含量在不同材料间的变异规律，探索叶片异黄酮含量与种子异黄酮含量及抗大豆花叶病毒病间的相关性，并结合SNP标记，挖掘控制叶片异黄酮含量的位点，为大豆叶片异黄酮含量的测定及遗传控制提供理论依据。

文献引用:

[1]孙君明, 韩粉霞.植物次生代谢产物异黄酮的调控机理[ J] .西南农业学报, 2005, 18(5):663-667.

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[5]鞠兴荣，袁建，汪海峰 . 高效液相色谱法测定大豆提取物中大豆异黄酮的含量［J］． 中国粮油学报，2000，15( 4) :26-29.

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研究的目标、内容和拟解决的关键问题

目标：

1）优化叶片异黄酮测定方法；

2）通过对自然群体不同材料的叶片异黄酮含量的测定，筛选高叶片异黄酮含量的材料；

3）通过与抗病性的相关分析，了解叶片异黄酮和抗病性之间的关系；

4）通过GWAS，寻找控制叶片异黄酮含量的候选基因位点。

内容：

1）优化叶片异黄酮测定方法；利用高效液相色谱法( HPLC)高效、快速、准确测定大豆异黄酮总量和各组分含量。

2）叶片异黄酮含量分析；通过将各种色谱分离方法与紫外检测器，质谱（MS）或串联质谱分析（MS / MS）相结合，大力开发异黄酮分析方法。

3）叶片异黄酮与种子异黄酮含量相关性分析；

4）叶片异黄酮和抗病性之间的关系；我们拟使用栽培大豆自然群体，优化叶片异黄酮含量测定方法，了解叶片异黄酮含量在不同材料间的变异规律，探索叶片异黄酮含量与种子异黄酮含量及抗大豆花叶病毒病间的相关性。

5）通过GWAS，寻找控制叶片异黄酮含量的候选基因位点。

拟解决的关键问题：

1）高效、快速、准确测定大豆异黄酮总量和各组分含量。

2）实验室高效的提取大豆异黄酮。

3）鉴定出大豆异黄酮合成相关基因。

4）通过将各种色谱分离方法与紫外检测器，质谱（MS）或串联质谱分析（MS / MS）相结合分析大豆异黄酮。