1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
卵菌中包含数量众多的重要植物病原菌，这些病原菌对寄主植物的破坏力强、危害大，常给农林业生产带来严重损失。它可侵染引致多种毁灭性病害，如大豆疫霉根腐病、马铃薯晚疫病和瓜菜类霜霉病、烟草黑胫病、茄类作物的某些根腐病等。随着测序技术的发展，数个疫霉菌的基因组序列测序已经完成[1-3]，极大的推动了卵菌的研究进展。辣椒疫霉属于卵菌门霜霉目腐霉科疫霉属，它寄主范围广泛，可以侵染多种蔬菜作物，造成毁灭性的病害，具有重要的经济学研究价值。除此之外，辣椒疫霉可以侵染模式植物拟南芥和本氏烟，已经成为卵菌研究的模式种[4]。
病原菌在与寄主植物互作的过程中，会分泌大量的效应因子进入寄主细胞，引起一系列的生理生化反应，干扰寄主细胞的代谢和防卫反应等，进而促进自身的侵染与繁殖[5]。例如丁香假单胞菌Ⅲ型效应分子AvrRto直接以FLS2和EFR为靶标来阻止PTI的信号，可能是通过抑制PRR的激酶的活性而起到的作用[5]；油菜黄单胞菌的效应分子AvrAC采用一种新颖的尿苷酰转移酶活性来抑制BIK1的激活从而促进毒力[5]。然而我们目前对绝大多数效应因子的功能及作用机制还知之甚少。
疫霉菌可以分泌两类效应因子，一类是胞内效应因子，另一类是胞外效应因子。胞内效应因子主要包括RxLR（R，精氨酸；x，任意氨基酸；L，亮氨酸；R，精氨酸）和CRN（Crinklingandnecrosis）两类[6]。近年来，已经报道了数个疫霉菌效应因子的毒性功能及作用机制。例如，研究发现致病疫霉菌的PiAvr3a可以与寄主植物的泛素降解过程中的一个E3连接酶CMPG1互作，促进致病疫霉菌的侵染[7]。致病疫霉菌PiAvrblb2可以通过与寄主植物蛋白酶C14互作，阻止其分泌到寄主细胞外，来干扰植物的防卫反应[8]。然而，我们尚不明确绝大多数RxLR效应因子的功能及作用机制。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
（1)明确辣椒疫霉效应分子RxLR103对植物抗病性的影响。
(2)研究辣椒疫霉效应分子RxLR103在病原菌与寄主互作过程中的作用。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
1、辣椒疫霉与拟南芥的培养
辣椒疫霉于V8平板上培养，在28度生化培养箱内培养。拟南芥野生型col-0播种前于4℃春化3天,盆播幼苗在20一25℃培养室内生长,营养生长时光周期为10h/14h（光/暗)。
2、辣椒疫霉RNA的提取与CDNA的合成
将辣椒疫霉菌株首先移植于V8平板上，在28度生化培养箱内培养3天后，取10块直径为的菌块移植于盛有液体培养基的培养皿中，于28度恒温摇床振荡培养天，过滤菌丝，放研钵内加液氮研磨至粉末状。然后使用试剂盒（OMEGAFugalRNAKit）。总RNA反转录合成的cDNA为模板，用根据基因序列设计的特异引物，进行RT-PCR扩增验证。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析。
3、效应分子基因克隆及重组质粒的构建
为了保证候选基因能够稳定在拟南芥细胞质内表达并行使功能，在设计引物时，上游引物序列都设计在信号肽剪切位点之后，保证最终得到的序列不被分泌到细胞外。基因扩增时以CDNA为模板进行高保真PCR扩增，所用高保真酶为PrimerSTARTMHSDNAPolymerase（TaKaRa，Japan）。PCR产物及相应载体经过酶切后用AgaroseGelDNAPurificationKit（TaKaRa，Japan）切胶回收。将酶切产物与pENTR-TOP载体连接，转化大肠杆菌DH5α，涂在含有kanamycin抗生素的平板上。待长出菌落之后，利用菌落PCR方法验证转化子，随后提取阳性克隆的质粒送公司测序并酶切验证。之后利用LRreaction将连在pENTR-TOP载体上的目的基因转移到双元载体pFAST/G01上，利用菌落PCR方法验证转化子，随后提取阳性克隆的质粒转化农杆菌待。
4、拟南芥的转化与筛选
将含有农杆菌的渗透缓冲液倒入于一烧杯中,倒转栽有拟南芥的花盆,使植株浸入含有农杆菌的渗透缓冲液中,浸泡30s,缓慢取出花盆,小心的放于保鲜膜上,包好植株,避光侧放,以增加农杆菌侵染时间。1d后取下保鲜膜,直立放置于花盆中。经转化处理的植株的果荚变黄后收获种子,去壳种子过筛,清除杂质将种子播于添加相应抗生素的琼脂筛选培养基（Amp,hyg）,4℃低温处理3d。光照培养箱发芽25℃，10h/14h（光/暗),4d后挑取根系和子叶生长正常的幼苗,移入营养钵中。
4、PFG介导的疫霉转化技术
为进步一研究辣椒疫霉诱导坏死蛋白基因家族功能，我们进行了基因沉默工作。根据沉默载体pHAM34 及各候选基因酶切位点，选择 SmaⅠ酶切位点设计引物。利用 Primer 3.0 设计各候选基因引物，扩增基因组 cDNA，将 PCR 产物回收酶切后与相应内切酶处理的 pHAM34 载体连接，然后克隆至大肠杆菌 JM109 感受态。经菌落PCR 及酶切验证后送公司测序验证用于后续试验。提取重组质粒，运用PEG介导的原生质体转化技术进行基因沉默的实验。挑取转化子并筛选稳定沉默的转化子并进行分子验证。
5、沉默转化子的致病性测定
在接种盘中铺上湿润的滤纸，取4-6周生长良好的本氏烟叶片，每个叶片在对称位置滴加10 μL无菌水；将在无抗生素的V8培养基上生长3d的菌落边缘部分用打孔器打取相同大小的菌碟，接种在本氏烟叶片的水滴位置。接种完成后用保鲜膜覆盖保湿，在25 ℃培养箱中黑暗培养。24 h后在紫外灯下观察并测量病斑大小，分别取大小相同的叶碟做定量分析。
技术路线
克隆基因 |
载体构建 |
遗传转化与筛选 |
基因沉默 |
实验方案：
本课题从克隆辣椒疫霉效应分子RxLR103基因入手，将其构建到植物表达载体pFAST/G01中，通过农杆菌介导的遗传转化体系，对野生型拟南芥Col-0进行稳定转化。随后筛选成功转化的拟南芥幼苗，获得RxLR103稳定转化的拟南芥株系，并检测活性氧爆发、胼胝质沉积等植物免疫相关指标，最后利用辣椒疫霉接种的方法鉴定RxLR103对植物抗性的影响。
可行性分析：
在国家自然科学基金重点项目等的资助下，本人所在实验室在疫霉分子生物学和植物与疫霉互作方面研究已有较好的工作基础，已构建了成熟的拟南芥转化体系，研究了多个重要基因的功能，上述工作为本项目的开展奠定了良好的基础。
近年来，本人所在实验室对多种疫霉效应分子功能、遗传变异与进化及致病机理开展了较系统的研究，发表了多篇高质量的SCI文章。本课题借鉴上述研究方法和技术路线，因而开展辣椒疫霉效应分子RxLR103的研究在技术上可行。
本人毕业实习所在的南京农业大学植保学院植物与疫霉互作实验室拥有从事分子生物学和植物遗传转化工作的所有设备和条件，能够满足项目实施的需要。学校的公共研究平台为我们的实验研究提供了足够的硬件支持。
4. 研究创新点
1、研究意义重要
辣椒疫霉病危害严重，该类病害在我国蔬菜种植区域发病程度日趋加重，严重影响了蔬菜种植业的发展和经济效益，给我国及世界各国的农业造成了巨大的经济损失。但是目前我国对该类病害还缺乏有效的控制策略。本项目通过对辣椒疫霉效应因子的研究，为寻找新的杀菌剂作用靶标，设计新的疫病控制策略提供理论指导。
2、研究方法新颖
5. 研究计划与进展
2015年09月克隆基因：辣椒疫霉效应分子RxLR103基因；
2015年10月构建载体：将其构建到植物表达载体pFAST/G01中；
2015年11月遗传转化和筛选：农杆菌介导的遗传转化体系，对野生型拟南芥Col-0进行稳定转化，并后续筛选；
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