1. 研究目的与意义
1.研究意义1.1从中药中筛选结直肠癌细胞保护性自噬抑制剂有利于克服化疗耐药，促进化疗药物敏感性，减少毒副作用，为研究中药的增效减毒效应开创新的思路，为临床中西药的联合应用提供理论依据。
结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，5-氟尿嘧啶(5-Fu)是结直肠癌化疗的一线用药，但由于肿瘤细胞对5-Fu产生多种耐药性，导致化疗疗效不理想，成为临床上结直肠癌患者治疗失败和死亡的主要原因[1]。
自噬在维持细胞内稳态中发挥着关键作用。
2. 文献综述
细胞自噬与结直肠癌的研究进展马梦楠（南京中医药大学 047113323 生物制药133）摘 要 结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，随着生活水平提高,饮食习惯改变,总体发病率也呈上升趋势。
自噬是广泛存在于真核生物中的生命现象，在进化上高度保守。
自噬与凋亡对于维持机体内环境的稳态和正常的生长发育有重要的意义，并且在肿瘤的发展过程中也起到不同程度的调控作用。
3. 设计方案和技术路线
第一部分 探讨木犀草素抑制5-Fu诱导结直肠癌细胞保护性自噬的机理技术路线： 研究方案：（1） 木犀草素抑制5-Fu等多种胁迫条件下诱导的结直肠癌细胞自噬的发生a. 检测自噬标志性蛋白LC3：用Lipofectamine 2000将编码GFP-LC3的质粒转染HCT116细胞，200 mg/L的G418筛选稳定转染细胞系。
木犀草素处理稳定转染细胞系24 h，Hoechst33258染细胞核后，荧光显微镜下观察结直肠癌细胞外源性GFP-LC3蛋白的分布；通过免疫印迹实，进一步检测木犀草素是否可以促进结直肠癌细胞内源LC3的降解。
b. 自噬标志性蛋白LC3的降解是否依赖于蛋白质酶体和溶酶体途径：根据预实验结果证实了木犀草素可以时间和浓度依赖性降解LC3蛋白，接下来将研究木犀草素通过何种途径促使LC3蛋白的降解。
4. 工作计划
2022年1月 ：学习细胞培养及细胞相关技术；学习Western blot、MTT比色法的原理、操作及其注意事项；搜索和查看相关文献，了解关于5-Fu、HCT116、木犀草素、细胞自噬、凋亡的知识；2022年2月：开始细胞培养，正确进行细胞复苏、传代、给药、种板、冻存等操作，练习并掌握检测细胞自噬与凋亡等技术，了解动物模型的建立及体内药效学评价的方法；2022年3月：探讨木犀草素抑制5-Fu诱导结直肠癌细胞保护性自噬的机理，检测自噬标志性蛋白LC3、研究自噬标志性蛋白LC3的降解是否依赖于蛋白质酶体和溶酶体途径、透射电镜检测自噬；2022年4月： 实验分组，检测不同给药组自噬及凋亡情况，检测相关蛋白和磷酸化水平，讨论木犀草素促进5-Fu诱导结直肠癌细胞凋亡是否依赖于p53-AMPK-mTOR途径；2022年5月-6月：进行动物模型的建立，将实验动物分组并给药，最后取材和检测各种指标，对木犀草素促进5-FU化疗增敏的体内药效学研究；分析总结实验结果，得出结论。
5. 难点与创新点
（1）本项目体现了中西医结合防治肿瘤的特色，是基于现代生物学研究成果基础上，开展中西药联合使用的基础研究：癌的发生发展是一个由多基因引起、多阶段的复杂过程。
化疗药选择性不强，且容易产生耐药性，癌症的化学治疗至今仍未取得重大进展。
增效减毒是中西医结合防治肿瘤的重要思想之一。
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