1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1、研究意义鼠尾草属(Salvia L.)为唇形科的一个大属，全世界约1000种，广布于热带、亚热带和温带。我国约83种、25个变种、9个变型，分布于全国各地，尤以西南为最。该属药用33种(含变种、变型)，其中丹参Salvia miltiorrhiza Bunge.为历版《中华人民共和国药典》收载的中药丹参唯一来源，但在实际应用中，同属多种植物的根及根茎均作为丹参用。丹参类中草药普遍有丹参酮等二萜类成分，具有活血化淤、抗菌消炎等功效。古有“一味丹参，功同四物”的说法：补血生血，功过归地；调血敛血，力堪芍药；逐痕生新，性倍川芍。其主要通过“养血”的功效来达到活血祛瘀的功效。丹参作为传统的活血化瘀中药，传统大宗药材之一，其主要化学成分为脂溶性的二萜类化合物和水溶性的酚酸类化合物。从1934年至1976年间，国内外对丹参进行了大量研究工作，先后从中分离得到15种成分，测定了结构式，并依次命名为丹参酮( tanshinone，Tan)Ⅰ、ⅡA、ⅡB，隐丹参酮，异丹参酮Ⅰ、ⅡA、，异隐丹参酮，轻基丹参酮Ⅱ，丹参酸甲醋，miltirone， salviol，二氢丹参酮Ⅰ，丹参新醌甲、乙和丙[1] 。在临床上，其活性成分的单体如丹参酮ⅡA、ⅡB，丹参素等在市场上广受欢迎。如丹参酮IIA磺酸钠注射液是从丹参分离出萜类化合物丹参酮IIA后经碘化而得到的一种水溶性药物，该药具有扩血管，降低血液粘滞度，抗血小板聚集，改善微循环和拮抗血管紧张素II，保护心肌细胞以及抗菌，抗炎等多种作用[2]。丹参素亦具有扩张动脉、预防脑血栓的发生、抗动脉粥样硬化、保肝抗炎的作用等[3]。在现代市场上，随着社会环境的不断发展，其活性成分单体的应用前景将会变得更为宽广。
2、现状分析
我国应用丹参已有两千多年的历史，丹参的利用虽然经历了从野生到家种的漫长过程，但是社会环境的发展，人类生活环境的变化，近年来随着对丹参需求量的增大，丹参野生植物资源日渐减少，致使市场和临床上常常出现应用人工栽培丹参取代野生丹参的情况。可因为长期人工栽培生产中只种不选，导致品种退化，混杂现象严重，药材的产量和质量下降，化学成分不稳定，因此丹参药材仍处于供不应求的状态。而丹参种质资源的遗传改良与创新研究就变得格外重要。
2. 研究的基本内容和问题
（1）研究目标：
本项目以白花丹参的芽和叶片为外植体，诱导出愈伤组织，对其分化出来的不定芽用秋水仙素溶液进行诱导。采用形态鉴别、根尖染色体鉴定和流式细胞仪分析相结合的方法对获得的种质进行鉴定，为药用白花丹参优良品种选育创制倍性育种材料提供新途径。
（2）研究内容：
3. 研究的方法与方案
（1）研究方法：
①外植体消毒: 用 75%酒精和0.1%升汞对外植体进行灭菌处理，设计处理时间分别为20S、4min，20S、5min，20S、6min，30S、4min，30S、5min，30S、6min。
②表1：不定芽诱导培养基配方筛选
| 编号 | 6-BA（mg/L） | NAA（mg/L） |
| 1 | 0.20 | 0.50 |
| 2 | 0.50 | 0.20 |
| 3 | 0.50 | 1.0
|
| 4 | 1.00 | 0.50 |
③表2：同源四倍体离体诱导条件优化
| 秋水仙素溶液浓度（ppm） | 处理时间（day） |
| 10 | 20d/25d/30d/35d/40d |
| 20 | 20d/25d/30d/35d/40d |
| 30 | 20d/25d/30d/35d/40d |
| 40 | 20d/25d/30d/35d/40d |
| 50 | 20d/25d/30d/35d/40d |
④表3：生根培养基配方筛选
| 编号 | ABT（mg/L） | IAA（mg/L） |
| 1 | 0.10 | 0.40 |
| 2 | 0.40 | 0.10 |
| 3 | 0.50 | 0.00 |
| 4 |
.00 | 0.50 |
| 5 | 1.00 | 0.50 |
| 6 | 0.50 | 1.00 |
| 9 | 0.50 | 0.50 |
⑤多倍体鉴定：
株型：植株矮壮的可初步判断为四倍体；
叶色：叶片变大、变厚，叶色浓绿的可判断为四倍体；
气孔观察：植株气孔的长和宽显著大于二倍体且单位面积内气孔密度显著小于二倍体可判断为四倍体；
叶绿体观察：保卫细胞叶绿体数目比未经过秋水仙素处理前明显变多的可判断为四倍体；
根尖染色体鉴定：对照二倍体根尖染色体条数为2n=2x=16，四倍体染色体条数则为2n=4x=32[1]；
流式细胞仪鉴定：对照二倍体DNA相对含量在100处有一个单峰，四倍体植株DNA相对含量在200处有一个单峰，是对照的2倍；
（2）技术路线：
实验方案
(1)实验材料
材料：白花丹参（Salvia miltiorrhza Bunge var. miltiorrhza f. alba C. Y. Wu et H. W. Li）
(2)实验方法
1.外植体的灭菌及接种培养
取植株上部刚展开的幼嫩顶芽（0.5～1cm）为外植体用洗衣粉洗净，以清洗附着在外植体上的灰尘或细菌，再用流动的清水冲洗20～30min。然后用滤纸吸干嫩芽上的水，放置在超净工作台进行灭菌。
用 75%酒精和0.1%升汞对外植体进行灭菌处理，处理时间分别为20S、4min，20S、5min，20S、6min，30S、4min，30S、5min，30S、6min。无菌水冲洗4～5次，接种到MS培养基上，每瓶接种外植体5个，放在25℃±2 ℃，平均光照12h，光强1200lx的培养室中进行培养。培养两周后，统计外植体的污染率和成活率。选用效果好、毒害小的一种消毒方法进行实验。
2.白花丹参愈伤组织、不定芽的诱导增殖
将用上述方法消毒过的芽接种在含不同激素种类和浓度的MS培养基中，6-BA（6-苄基腺嘌呤）设3个浓度梯度：0.20、0.50、1.00；NAA（萘乙酸）设3个浓度梯度：0.20、0.50、1.00，见研究方法中表1。在每种配比的培养基中接种30个外植体，定期统计各组合出芽早晚、不定芽诱导率和生长状况，筛选最佳不定芽诱导培养基。
3.同源四倍体离体诱导
将分化诱导20d的不定芽分别接种在添加了浓度为10ppm、20ppm、30 ppm、40 ppm、50 ppm、秋水仙素MS培养基中，分别培养20d/25d/30d/35d/40d，每个处理为30个不定芽，培养在MS培养基中的白花丹参作为对照（CK），见研究方法中表2。浸泡后的不定芽用无菌水冲洗3～4次，滤纸吸干水后进行壮苗培养。
5. 同源四倍体的分化培养
将诱导过后的白花丹参植株转移到繁殖培养基中进行继代培养，两代之后进行四倍体鉴定。
6.同源四倍体鉴定
形态鉴别：从植株大小、叶色、叶面积、气孔、保卫细胞中叶绿体数目、生长状况等相关的外部特征来初步筛选变异植株。
根尖染色体鉴定：以白花丹参组培苗的幼嫩根尖为材料进行常规压片，观察中期分裂像的染色体数目。具体步骤为：待根长至2～3cm时，8︰00～9︰00切取根尖用水洗净，切取刚萌发试管苗根0.5cm左右，在蒸馏水中冲洗3次，放入0.1%秋水仙碱溶液中处理1.5 h，取出后用蒸馏水洗3次，再放入卡诺固定液中固定2h，然后依次用95%与70%乙醇、蒸馏水各洗3次，再用混和酸(45%醋酸，1 mol盐酸、1%硫酸按100:10:1混和)于室温下离析80min，最后水洗3次，放入70%乙醇中保存供镜检。镜检时取根尖2～3条，置于载玻片中央，小心切取根尖0.1cm，加改良苯酚品红染液一滴，0.5 h后盖上盖玻片并轻压轻敲至根尖压成一薄层，用显微镜进行观察并摄影[2]。
流式细胞仪鉴定：取组培苗叶片3～4片，用滤纸吸干水，置干净的培养皿中。加入0.5mL预冷的组织解离液［15mmol/LTris，20mmol/LNa2EDTA，80mmol/LKCl，20mmol/LNaCl，0.1%TritonX-100(V/V)，0.117％ β-巯基乙醇(V/V)，pH 7.5］，用锋利的刀片迅速将叶片切碎，200目尼龙网过滤，1000r/min离心5min，漂洗3次。加入DAP I（100ng/mL）染色液2.0mL，室温下静置反应10min。用移液器吸出组织解离混合液，通过Partec流式细胞仪专用漏斗过滤至上样管中，随即上机测定样品DNA含量，以确定植株倍性，以二倍体为对照[3]。
参考文献：
[1]陈力,李秀兰.白花丹参同源四倍体的诱导与鉴定[J].中草药,2009,40(12):1995-1997.
[2]高山林,徐德然,蔡朝晖,朱丹妮.丹参同源四倍体新物种的培育[J].中国药科大学学报,1992(04):224-228.
[3]张振超,张蜀宁,张伟,张红亮.四倍体不结球白菜的诱导及染色体倍性鉴定[J].西北植物学报,2007(01):28-32.
4. 研究创新点
（1）材料创新：
经过系统CNKI中国知网数据库系统的系统检索，未见关于药用白花丹参以芽和叶片为外植体的无菌快繁体系的建立与在其基础上获得同源四倍体种质的报道；
（2）技术创新：
5. 研究计划与进展
本研究预期在18个月内完成
2018.2-2018.4：收集资料，完成研究方案设计；
2018.4-2018.7：建立白花丹参无菌快繁体系；
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