1. 研究目的与意义
内容：本课题以常用中药天冬（Asparagus cochinchinensis(Lour)Merr，Ac）、姜黄（Curcuma longa L.，Cl）、姜（Zingiber officinale Rosc.，G）、天麻（Gastrodia elata Bl.，Ge）、百合（Liliumbrowniivar.viridulum，Lb）、人参（Panax ginseng C. A. Mey.，Pg）及黄精（Polygonatum sibiricum，Ps）等为原料。利用超速离心和超滤等技术建立胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）分离(在初步分离基础上建立纯化和组装工艺)工艺，通过系统的工艺优化研究建立稳健的EVs分离、纯化和组装工艺；利用动态光散射（dynamic light scattering，DLS）和纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）等技术对EVs物理性质(粒径、电位等)进行系统评价；分析不同中药来源囊泡体内分布、细胞摄取行为的差异与囊泡理化性质间的关系。
意义：本课题利用现代药剂学方法对EVs分离、纯化工艺、理化性质等方面进行系统研究，分析不同中药来源囊泡体内分布、细胞摄取行为的差异与囊泡的理化性质关系，给中药资源开发和中药药效物质基础研究提供新的思路和方向。
2. 文献综述
动物细胞外囊泡的研究进展：来源、结构与功能
药物制剂15 孙 娟 048015139
摘 要 几乎所有的细胞都可以产生和释放大量的胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，根据尺寸不同，EVs主要被分成外泌体(exosome)、微泡(microvesicles)和凋亡小体(apoptotic body)等三种。EVs以磷脂双分子层为基本骨架，其内容物包括脂质、蛋白质和核酸等，可介导细胞间通信和大分子的传递，影响靶细胞的生理和病理过程。以外泌体为代表的EVs，广泛存在于各种体液中，参与组织修复，协助免疫监视和促进免疫逃逸，转运转录因子mRNA，并通过蛋白质和脂质配体激活细胞表面受体，因而广泛应用于疾病的诊断与治疗。外泌体可作为疾病诊断的生物标志物、可开发为以外泌体为基础的疫苗，也可应用于药物递送系统。对EVs来源、结构与功能的深入理解，将有助于拓展人类对疾病的研究思路，为未来的精准医学提供更有效的治疗靶标和更合理的干预策略。
3. 设计方案和技术路线
研究方案 1 胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）分离、纯化工艺的确定 1.1 EVs提取及分离 利用差速离心技术从七种鲜中药天冬（Asparagus cochinchinensis(Lour)Merr，Ac）、姜黄（Curcuma longa L.，Cl）、姜（Zingiber officinale Rosc.，G）、天麻（Gastrodia elata Bl.，Ge）、百合（Liliumbrowniivar.viridulum，Lb）、人参（Panax ginseng C. A. Mey.，Pg）及黄精（Polygonatum sibiricum，Ps）汁液中进行EVs分离，实验过程中对各个离心步骤中样品的粒径分布进行监测，根据粒径监测结果对离心程序所涉及的中药汁液稀释倍数、各步骤的离心力和离心时间进行适当调整，建立EVs提取、分离工艺。 1.2 EVs重新组装 根据实验具体情况，利用超声或高压均质技术对EVs进行组装，以粒径为指标，利用科学的试验方法对工艺参数进行优化，建立EVs组装工艺。 1.3 EVs纯化 利用超滤法，以相应中药材已报道质控指标(活性成分)为指标，建立EVs纯化工艺。 2 EVs的表征 利用动态光散射（dynamic light scattering，DLS）和纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）等技术对EVs物理性质(粒径、电位等)进行系统评价。 2.1 DLS实验 取EVs用H2O 稀释成合适浓度，用马尔文粒度测定仪测定EVs的粒径、多分散系数（polydispersity index，PDI）及Zeta 电位。 2.2 NTA实验 取EVs用H2O稀释成合适浓度，利用NTA技术测定EVs的粒径、粒子浓度及粒径均匀度。 3 EVs稳定性考察 以粒径PDI和Zeta电位为指标，评价EVs在室温、4℃、-20℃和-80℃储存条件下的稳定性，并确定EVs的储存条件。 4 EVs口服生物分布规律 4.1 EVs的标记 取1 mL EVs加入5 μL PKH 26染料，37℃孵育5 min，加入等体积的纯水，选用10 kDa超滤管3000 rmin -15 min超滤5次，除去游离PKH 26染料后备用。 4.2 EVs口服给药方式组织分布规律 利用活体成像技术法评价EVs口服给药在雄性 BALB/c裸鼠体内的分布规律。取雄性 BALB/c裸鼠24只，随机分为Ac组、Cl组、G组、Ge组、Lb组、Pg组、Ps组和空白组，以灌服纯水作为空白组，按100 mg/kg灌胃给药，分别在给药后1、2、4、8、12、24h置于活体成像仪中进行拍摄并统计荧光强度。活体成像结束后，迅速对裸鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、十二指肠段、空肠段、回肠段及结肠段进行离体脏器成像，考察口服给药的组织分布规律。 5 EVs细胞摄取及机制的考察 5.1 EVs细胞摄取量及速率考察 评价Raw 264.7和HepG 2细胞对EVs摄取量及速率的差异。分别将密度为1104 cfu/mL的Raw 264.7和HepG 2 细胞播撒在12孔细胞培养板上。取七种EVs分别与细胞共孵育 0.5、1、2 h。孵育后，用1 mL PBS清洗3次，消化细胞，置于相应Ep管中，500 g离心5 min，弃去上清，用400 μL培养液重悬细胞。选用与PKH26激发波长相近的激发光通道，用流式细胞分析仪分析细胞的摄取情况。 5.2 EVs摄取机制考察 选择不同细胞摄取抑制剂对Raw 264.7和HepG 2细胞进行预处理，通过比较细胞摄取抑制剂处理后细胞对EVs摄取量的变化评价EVs的摄取机制。 技术路线： |
4. 工作计划
2022年1月：文献调研。
2022年2月-3月：七种鲜中药来源EVs分离、纯化工艺的建立及物理性质表征的研究。
2022年4月-6月：七种鲜中药来源EVs口服给药体内过程评价及EVs细胞摄取及机制的考察。5. 难点与创新点
本课题利用纳米靶向技术在肿瘤治疗的研究思路，首次选择中医药广泛应用的传统中药天冬、姜黄、姜、天麻、百合、人参及黄精为研究对象，利用超速离心和超滤技术对EVs进行分离纯化，通过对几种EVs理化性质等方面进行系统研究，给中药资源开发和中药药效物质基础研究提供新的思路和方向。
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