1. 研究目的与意义
一、内容
提取香附四物方中含有的挥发性成分：当归、熟地黄、川芎、白芍、延胡索乙素、香附、木香等。本实验采用水蒸气蒸馏法提取主要成分的挥发油，提取实验用量后，经过GC-MS检测分析后，使用皮肤电阻法测定挥发油对离体皮肤电阻的影响，评价其透皮促渗效果，进行离体子宫实验考察挥发油的药理活性。
二、意义
2. 文献综述
皮肤电阻法在经皮给药系统中的应用
摘要： 皮肤的屏障功能主要是由角质层导致的，为了减少角质层屏障功能的影响，主要有离子法、超声促渗法和加入化学促渗剂等。在实际应用中，为了快速优选处方，需要建立一种高通量的筛选技术，以用于促渗效果的评价和相关机制的研究。皮肤电阻法是一种评价经皮给药系统实验的一种方法，本文综述了皮肤电阻法在皮肤完整性评价、高通量筛选、机制研究、操作方法及影响因素。
3. 设计方案和技术路线
（1）香附四物方组分的分离、分析
a.分离
取一定重量饮片，粉碎至一定粒度，加入3000mL圆底烧瓶，加入一定倍数的蒸馏水，连接挥发油提取器和冷凝管，自冷凝管上端加蒸馏水至溢出挥发油提取器支口。浸泡，加热保持微沸适当时间，至挥发油的量不再增加，停止加热。室温下放置1小时，接收挥发油，加入适量无水硫酸钠脱水，离心并转移至棕色玻璃瓶中，4℃下避光密封保存待用。
b.GC-MS分析
取各样品挥发油0.10g，精密称定，置于10mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度线。取适量12000rpm离心10min，取上清液待测。
色谱条件：Agilent HP-5MS气相色谱柱（30mm0.25mm0.25μm）；程序升温：起始柱温60℃，保持4min，以2℃/min速度升温至110℃后，再以1℃/min速度升温至160℃，最后以10℃/min速度升温至250℃，保持3min；汽化室温度250℃；载气为高纯氦气，流速为1mL/min；分流进样，分流比1：20，进样量2μL。质谱条件：离子源温度250℃，电离方式EI，电子能量70eV，溶剂延迟4min，扫描质量范围m/z 35-500。
（2）促渗效果评价
取各挥发油30mg，溶于异丙醇：PBS（7：3）1mL混合溶剂中，氮酮和空白为对照。取用雄性SD大鼠腹部皮肤作为实验材料，实验前一天腹部刮毛，次日处死取皮，去除脂肪层，置于-20℃冰箱保存备用，采用细胞电阻仪嵌套装置测定电阻。将离体大鼠皮肤角质层面上，固定于嵌套上，嵌套装置供给室加入挥发油溶液200μL，接收室加入650μL70%异丙醇PBS，测定0、1、2、3、4、5、10、15、20、40、60min电阻值。
（3）药效学研究
取未孕雌性小鼠，体重18-22g，实验前连续3天腹腔注射苯甲酸雌二醇1mg.kg-1.d-1，于第4日取出小鼠子宫，清洗，用细线分别扎住子宫颈端及两侧卵巢端，一端固定于洗槽底部，一端连接在张力换能器上。置于20mL Lockes液恒温浴槽中，温度为37℃，持续供氧。通过调节螺母加1g的负荷，平衡40min，待子宫收缩稳定，自发节律恢复后，开始进行实验。预先记录5-10min正常收缩曲线，加入缩宫素注射剂10ul，终浓度为5ul/L，作用15min后加入供试品，各供试品加入的初始浓度为10mg/mL，终浓度为0.01mg/mL。观察供试品对子宫痉挛性收缩的抑制作用，采用T检验比较给药前后子宫收缩幅度和收缩频率，计算抑制子宫收缩的百分率（%），计算公式：IR%=（给药前参数-给药后参数）/给药前参数100%。
水蒸气蒸馏 |
当归4.5kg、熟地黄6kg、川芎2.25kg、白芍2.25kg、延胡索乙素2.25kg、香附2.25kg、木香1.5kg |
单味挥发油/混合挥发油 |
GC-MS |
离体皮肤电阻测定 |
离体子宫实验 |
高促渗、药理活性挥发油
4. 工作计划
2022/01/032022/01/20：查看相关文献资料，确定实验挥发油提取方法及分析方法；电阻法评价促渗效果需要的设备型号，样品处理方法，实验参数；离体子宫实验方法。
2022/01/202022/03/01：撰写文献综述，设计实验方案，摸索实验条件。
2022/03/022022/03/12：撰写开题报告。
5. 难点与创新点
皮肤电阻法评价经皮吸收促渗效果有如下的优点：需要的动物皮肤样本少；
测量时间短，测量灵敏，可以实时获得测量结果；可以快速评价促渗剂的促渗效果；以皮肤电阻法评价促渗剂的促渗效果，无需考虑处方组成之间的相互作用。
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