利用彗星实验研究西维因对罗非鱼的遗传毒性开题报告

 2023-02-12 12:30:30

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

单细胞凝胶电泳技术(Single cell gel electrophoresis，SCGE)又称之为彗星实验(Comer assay)，是一种快速，简便，灵敏的检测单个细胞DNA断裂的新技术方法，其原理：在细胞裂解液的作用下，包埋在琼脂糖中的细胞其细胞膜，核膜等生物膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质，RNA及其他成分进入琼脂糖中从而扩散到细胞裂解液中，DNA则由于其高分子量留在原位。

在碱性电泳液的作用下，DNA解旋，未受损的核DNA保持原状，形似球状，无拖尾现象。

损伤的DNA片段由于分子量小，在电泳过程中离开核DNA，向阳极迁移，形成彗星状的图像，DNA损伤越严重断链及碱易变性片段越多，断链越来越小，电泳过程中，向阳极迁移的DNA量越多，迁移距离越长。

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2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标利用彗星实验研究西维因对罗非鱼肝脏、性腺细胞DNA的损伤，证明西维因对罗非鱼是否具有DNA损伤作用。

2、研究内容在不同时间梯度和不同浓度梯度的毒物西维因下，以罗非鱼为研究对象，主要探讨以下几个问题：（1）不同时间暴露下西维因对罗非鱼肝脏和性腺的影响。

（2）不同浓度下西维因对罗非鱼肝脏和性腺的影响。

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3. 研究的方法与方案

1、研究方法研究不同时间梯度下，不同浓度梯度的毒物西维因对罗非鱼肝脏细胞DNA和性腺细胞DNA的影响。

2、技术路线西维因暴露→不同梯度下西维因对罗非鱼DNA的损伤→是否具有基因毒性3、实验方案3.1实验材料罗非鱼为受试动物；西维因；丙酮为助溶剂等3.2仪器低温冷冻离心机3.3实验步骤（1）取组织，制备单细胞悬浮液，计数活细胞数，调整细胞浓度（2）制片，细胞悬浮液和0.7％低熔点琼脂糖1:10混合，铺胶（3）细胞裂解，至少2小时（4）细胞解旋，30分钟，（5）电泳，20分钟，25 V，300mA（6）中和，10分钟，三次；乙醇固定，5分钟（7）染色，EB 30s（8）荧光显微镜观察，拍照（9）CASP分析，SPSS 统计4、可行性分析本实验方案逻辑性强，且本实验课题组拥有丰厚的实验资源、设备，是在验证性实验的基础上进一步进行延伸和探究，通过研究西维因对罗非鱼DNA的影响，相信能在一定程度上深刻西维因对罗非鱼损害的研究。

4. 研究创新点

西维因作为环境内分泌干扰物影响机体内分泌系统，损害生殖系统，影响罗非鱼生长健康，因此，对西维因的研究具有重大的现实意义。

近年来国内外对西维因的毒性及内分泌干扰效应的研究有一定进展，但涉及到基因和机制层面上的实验研究较少，本课题通过研究西维因对罗非鱼DNA的损伤，可以进一步了解西维因存在于环境中对生物体的遗传毒理性影响

5. 研究计划与进展

2、预期结果证明西维因对罗非鱼是否具有DNA损伤3、可能存在的问题 （1）精子细胞过小影响彗星实验的取材（2）碱性电泳时实验材料容易脱片

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