1. 研究目的与意义
线粒体（mitochondrion）是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为power house。其直径在0.5到1.0微米左右。线粒体拥有自身的遗传物质和遗传体系，但其基因组大小有限，是一种半自主细胞器。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。
线粒体DNA(mitochondrion DNA , mtDNA)是一条双链(H 链和L 链)超螺旋环状DNA 。目前mtDNA 结构与功能的研究已成为分子进化、疾病诊断、细胞衰老与凋亡、经济性状等领域研究的有力工具线粒体DNA是目前分子生物学研究的一个重要的领域，而鱼类mtDNA是鱼类分子系统学研究和群体遗传分析的重要标记。
鲀科（Tetraodontidae），硬骨鱼纲，鲀形目下的一科，通称鲀。有16属约118种。体粗短或亚长椭圆形，头及吻宽钝。个别种如鲀属有些体长可达900毫米。主要分布于太平洋、印度洋和大西洋热带。一般栖息在近海及咸淡水中，有些能进入江河，也有少数鲀属的种类仅生活与淡水内。
2. 研究内容和预期目标
研究内容：
1.鲀目鱼类线粒体基因组DNA的分离优化；
2.目的基因线粒体ND5基因的克隆和鉴定；
3. 研究的方法与步骤
3.1鲀目鱼线粒体DNA 的制备
活体解剖，取肝脏组织和背部肌肉用酚-氯仿抽提法提取线粒体DNA。取鱼背部肌肉和肝脏组织适量于 1.5 mL的 Eppendorf 管中，用蒸馏水、TE（10 mmol/L Tris.HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0）缓冲液浸泡，直到组织中无酒精味。然后加入 620 #181;L 的 STE（0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0）细胞裂解液，70 #181;L 10%的 SDS，10 #181;L 蛋白酶 K（10 #181;g/#181;L），置于 55℃的恒温箱中消化至透明。加入等体积的平衡酚抽提两次（pH 值），再加入等体积的氯仿#8722;异戊醇（24∶1）抽提，至无蛋白质。加入上清液两倍体积的无水乙醇沉淀 2 h 以上，离心后再用 75%的乙醇洗涤沉淀，再离心去乙醇干燥后加入 30～50 #181;L 的灭菌双蒸水或 TE 缓冲液溶解，并存于#8722;20℃的冰箱中备用。
高盐抽提法，取鱼背部肌肉适量于 2 mL 的Eppendorf 管中，剪碎烘干，加入 500 #181;L HOM Buffer和 10～15 #181;L 蛋白酶 K，置于 55℃的恒温箱中消化至透明。加入 500 #181;L NaCl（4.5 mol/L），300 #181;L 氯仿离心。加入 600 #181;L 异丙醇沉淀，于#8722;20℃保存 1 h以上，离心后再用 70%乙醇洗涤，干燥后加入 50 #181;L灭菌双蒸水溶解，存于#8722;20℃的冰箱中备用。
4. 参考文献
[1] 肖武汉, 张亚平. 鱼类线粒体DNA 的遗传与进化[J]. 水生生物学报, 2000, 24(4): 228-236.
[2] 郭新红, 刘少军, 刘巧, 等. 鱼类线粒体DNA 研究新进展[J]. 遗传学报, 2004 , 31(9) : 983- 1000.
[3] 刘丽, 刘楚吾, 张明辉, 等. 不同保存条件下鱼类组织基因组DNA的提取效果分析[J]. 广东海洋大学学报, 2007, 27(6):19-22.
5. 计划与进度安排
（1）2024-2024-1学期17-20周—2024-2024-2学期第1周：接受任务书。查阅资料，确定所选基因，准备开题报告，外文论文翻译。
（2）第2周---第4周：综合相关文献资料，撰写开题报告，完成实验前准备工作，掌握配制各实验所需药品；学习提取鱼的基因组DNA和扩增线粒体相关基因的方法。学会使用PCR仪，对PCR反应体系，循环参数进行摸索和调整等措施，学会制胶，学习制备感受态细胞，PCR目的基因。
（3）第5周---第12周：掌握PCR扩增产物的鉴定与割胶回收，回收纯化产物与载体连接，转化到感受态细胞中，利用白斑筛选阳性克隆，用质粒DNA小量试剂盒提取质粒，用双酶切鉴定阳性菌落，阳性菌落质粒DNA送到生物公司进行测序。
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