1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪链球菌（Streptococcussuis ，SS）是一种革兰氏阳性菌，血清型众多，其中2型（SS2）分离率最高，致病性也最强。SS可引起猪脑膜炎、败血症、脓肿等；也可感染人，引起脑膜炎、感染性休克，严重时可致人死亡[1,2]，是一种重要的人畜共患病原菌。1968年在丹麦首次报道了猪链球菌感染人的病例[3]，1998年在江苏和2005年在四川均爆发由SS2感染引致的猪链球菌病，导致猪群发病并死亡，分别引起25人感染14人死亡和215人感染38人死亡[4,5]。目前在欧洲、美洲、大洋洲及亚洲等多个国家均有人感染SS的报道。
在血液中是否存活对于猪链球菌感染和致病至关重要[6]，目前发现参与猪链球菌在血液中存活的毒力因子多数为细菌表面成分、表面蛋白、胞外蛋白、酶类、调控因子等，直接或间接参与黏附宿主细胞、体内存活等。近年来，细菌小RNA（small RNA,sRNAs）的研究备受关注，致病菌sRNAs可作为细菌毒力调控关键因子，促进细菌在宿主体内增值及感染[7]。细菌sRNA一般是大小为40 ~ 500 nt的RNA分子，主要包括位于基因间隔区的非编码RNA、产生于mRNA的互补RNA等[8]。猪链球菌非编码sRNA作为新型独立调控因子，可直接或间接调控毒力基因表达，从而影响猪链球菌毒力[9]。
课题组前期通过实验室鉴定猪链球菌29个sRNA，并发现5个sRNA与毒力有关，其中sRNA rss03缺失株在猪血中存活能力和对斑马鱼毒力均显著降低[9]，但rss03的直接靶位及其调控机制尚未明确。
2. 研究的基本内容和问题
1 研究目标
1.1 构建pLUG220-rpoB-候选靶位基因（NJAUSS_RS06365、NJAUSS_RS04010、NJAUSS_RS04015）-LacZ-氯霉素（CHL）等3个重组质粒。
1.2 通过LacZ翻译融合的方法，验证rss03的候选靶位。
3. 研究的方法与方案
1 研究方法
1.1 构建pLUG220-LacZ-CHL重组质粒
1.1.1引物设计 设计LacZ中自Sac I酶切位点处至末端片段的上下游引物A-LacZ和B-LacZ，A-LacZ 引物5’端包含Sac I酶切位点；设计CHL上下游引物C-CHL和D-CHL，C-CHL引物5’端添加引物A-LacZ的反向互补序列，D-CHL引物5’端添加Pst I酶切位点。
4. 研究创新点
1. 目前对猪链球菌毒力的研究主要集中于蛋白质和细菌表面成分等传统的毒力因子，而深入研究sRNAs调控猪链球菌毒力的较少。
2. 通过MS2识别序列标签纯化技术和生物信息学等方法预测rss03的候选靶位基因后，经LacZ翻译融合方法进行验证，为鉴定 rss03直接靶位及深入阐明rss03调控机制提供参考。
5. 研究计划与进展
1 研究计划
2020年3月-2020年4月：构建pLUG220-rpoB-候选靶位基因（NJAUSS_ RS06365、NJAUSS_ RS04010、NJAUSS_RS04015）-LacZ-CHL共3个重组质粒；
2020年4月-2020年5月：通过LacZ翻译融合方法验证rss03的候选靶位基因。
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