1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
无乳链球菌是一种在自然界广泛存在的革兰阳性致病菌，是造成我国罗非鱼链球菌病的主要病原，该菌不仅可以引发鱼类的脑膜脑炎，还是人类新生儿败血症和脑膜炎，牛乳腺炎的主要病原菌之一，感染严重者可危及生命。近年来，抗生素的不合理使用导致链球菌的耐药性逐年增加，使得发展新型抗菌制剂迫在眉睫。
噬菌体裂解酶被认为具有巨大潜力的抗菌制剂，其可通过作用于细菌细胞壁来发挥抑菌功能。噬菌体裂解酶在体外及动物体内模型实验中显现出良好的杀菌活性，且至今尚无对动物或人体产生毒性的报道，噬菌体裂解酶的裂解特性使其在预防、治疗细菌感染方面拥有广阔的应用前景。
2. 研究的基本内容和问题
目标：
（1）诱导重组表达菌的表达；
（2）裂解酶的纯化与超滤；
3. 研究的方法与方案
实验方案：
（1）重组表达菌的诱导表达：将重组表达菌株lys0643-pET28a-BL21在-80℃取出，室温解冻，接种于含卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜，平板上随机挑选单菌落接种到5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm震荡培养10h。然后取出500μL菌液接种到50mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的锥形瓶中，37℃、180rpm震荡培养3h，加入IPTG（终浓度5mM），37℃、180rpm震荡培养4h，进行诱导表达。取1mL菌液10000rpm离心5min，弃上清，通过SDS-PAGE电泳检测获得重组蛋白表达情况，获得可表达裂解酶的0643-pET28a-BL21 ，该裂解酶为可溶性表达。使用上述方法诱导表达1000mL菌液。
（2）裂解酶的纯化与超滤：将上述1L的诱导表达培养液于4℃、10000rpm离心10min，获得的细胞沉淀用1×PBS重悬后离心，反复三次。获得的细胞沉淀于-20℃冷冻一晚后，再加入20mL上清溶解buffer溶解沉淀；在冰浴条件下进行超声破碎，工作时间5s，间隔10s，直至菌液变清亮。将破碎后的细胞于4℃、10000rpm离心10min，将得到的上清液依次用0.45μm、0.22μm的滤膜过滤，即获得裂解酶的粗提液；然后使用镍蛋白柱对粗酶液进行纯化，最后使用超滤管进行超滤，通过SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。
4. 研究创新点
抗生素耐药性日益严重的今天，开发新型抗菌剂迫在眉睫，噬菌体作为自然界中天然存在的杀细菌病毒，随着细菌的进化而进化，细菌产生抗药性的几率极低。
本实验通过探索一个无乳链球菌裂解酶的体外最适裂解环境，为将来该裂解酶应用于临床摸索条件；本实验在体外实验的基础上增加动物模型实验，摸索最佳给药方式，这在之前的文献中鲜有提及。
5. 研究计划与进展
2020/01 成功构建重组表达质粒，转化表达菌株，完成该裂解酶的诱导表达与纯化，初步摸索该裂解酶的体外抗菌活性。
2020/05 完成链球菌裂解酶生物信息学分析
预期结果：得到plyGBS0643裂解酶的纯化产物，在体外和体内条件下证明该裂解酶的高效抑菌活性。
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