1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp）引起的一种猪慢性呼吸道传染病。我国最早于二十世纪四十年代发现此病，近些年来，此病有愈演愈烈的趋势，已成为严重威胁养猪业发展的疾病之一。该病死亡率低，但发病率高，且难以根除。典型的猪支原体肺炎的临床症状主要表现为干咳和气喘，病猪常见食欲不振，生长缓慢，严重影响猪场经济效益 [1,2]。
猪是MHP唯一的宿主，MHP主要定植于猪下呼吸道的纤毛上皮细胞中[3]，在猪呼吸道纤毛间移行，致使纤毛摆动停滞，甚至受损缺失[4]，是其致病的主要原因。由于纤毛损伤导致的纤毛摆动功能受阻，使呼吸道中包括细菌等外来异物不能被及时清除，因此MHP会引起猪的混合感染和继发感染产生猪呼吸道复合症。
目前猪场主要通过疫苗免疫、药物治疗以及环境控制这三个方面来防控猪气喘病，其中优质有效的疫苗对猪群进行预防免疫是控制该病的核心，有文献报道，国外已成功通过免疫控制净化猪气喘病。现阶段猪气喘病疫苗主要以灭活苗为主，国内的168弱毒疫苗也占有一定的市场份额。
2. 研究的基本内容和问题
1.1研究目的
本研究着重对猪支原体肺炎活疫苗及灭活疫苗的两种水佐剂的稳定性进行评价，为疫苗产品的开发提供基本数据。
1.2研究内容
以小鼠为模型，采用保存了不同时间的佐剂制备猪肺炎支原体活疫苗或灭活苗，以新鲜配制的佐剂为对照，通过检测血清抗体产生情况，考察猪肺炎支原体活疫苗或灭活苗佐剂的稳定性。
3. 研究的方法与方案
2.1 研究方法
（1）小鼠的准备：
18-20g的雄性昆明小鼠80只，4-5周龄，置于江苏省农业科学院动物房进行饲养。
（2）免疫方法：
将处理后的佐剂与疫苗一起免疫小鼠，注射方式为左右后腿肌肉注射。动物免疫2次，于首次免疫后2周再次免疫。
（3）采血方法：
进行眼眶采血。
（4）血清抗体的测定方法：
用间接ELISA法测定猪肺炎支原体特异性IgG。OD450-630酶标读数。
2.2技术路线
2.3实验方案
2.3.1小鼠的准备
18-20g的雄性昆明小鼠80只，4-5周龄，每隔一天喂食喂水，记录情况，每周更换两次垫料。
2.3.2动物分组说明
将小鼠随机分成10组，每组8只，灭活苗佐剂设为G2-4组，活苗佐剂设为G5-10组。
2.3.3具体免疫分组情况见表
动物试验设计
组号 | 组别 | 佐剂成分 | 配制时间 | 存放条件 | 存放时长 | 外观 | 疫苗 | 疫苗苗剂量 |
G1 | 阴性对照 | |||||||
G2组 | 灭活苗组1 | 佐剂1 | 20140815 | 4度 | 12月 | 正常 | 灭活疫苗 | 107CCU/只 |
G3组 | 灭活苗组2 | 佐剂1 | 20150828 | 4度 | 正常 | 灭活疫苗 | 107CCU/只 | |
G4组 | 灭活苗组3 | 佐剂1 | 20150828 | 37度 | 28天 | 正常 | 灭活疫苗 | 107CCU/只 |
G5组 | 活疫苗组1 | 佐剂2 | 20130412 | 4度 | 整体存放28月 | 正常 | 活疫苗 | 106CCU/只 |
G6组 | 活疫苗组2 | 佐剂2 | 20140227 | 4度 | 整体存放18月 | 正常 | 活疫苗 | 106CCU/只 |
G7组 | 活疫苗组3 | 佐剂2 | 20140227 | 4度 | 整体存放18月 | 有浑浊 | 活疫苗 | 106CCU/只 |
G8组 | 活疫苗组4 | 佐剂2 | 20150828 | 4度 | 正常 | 活疫苗 | 106CCU/只 | |
G9组 | 活疫苗组5 | 佐剂2 | 20150828 | 37度 | 整体存放28天 | 正常 | 活疫苗 | 106CCU/只 |
G10组 | 活疫苗组6 | 佐剂2 | 20150911 | 4度 | 黄芪多糖存放16月 | 正常 | 活疫苗 | 106CCU/只 |
2.3.4灭活疫苗免疫
取猪气喘病灭活疫苗与佐剂1:1混合，每只动物免疫150μl。注射方式为左右后腿肌肉注射。动物免疫2次，于首次免疫后2周再次免疫。
2.3.5活疫苗免疫
取猪气喘病活疫苗（168株）冻干粉4瓶（2ml/瓶，含2107CCU)，每瓶用3ml不同保存期佐剂溶解，最后得到3ml疫苗溶液（含6107CCU CCU），此为20动物的一次免疫剂量，每只动物免疫150μl 即106CCU。从溶解到免疫时间不可超过30分钟。注射方式为左右后腿肌肉注射。动物免疫2次，于首次免疫后2周再次免疫。
2.3.6 血清抗体水平测定
以猪肺炎支原体全菌蛋白为包被抗原，用实验室建立的间接ELISA方法检测血清中特异性IgG抗体水平，比较不同佐剂组之间差异，以评价佐剂的稳定性。
2.4可行性分析
用小鼠模型检测疫苗免疫效果具有稳定性强、数据平行行好、个体差异小、试验成本低的优势，适合用于同一佐剂的保存期比较。
猪支原体肺炎疫苗免疫后可诱导产生血清IgG抗体，用其作为评价指标较为稳定和方便。
小鼠的培养、小鼠肌肉注射，小鼠眼眶采血，间接ELISA都是实验室常规操作技术；实验设计中的各项关键技术均有研究资料可以借鉴。因此，本项目研究方案是完全可行的。
4. 研究创新点
佐剂作为疫苗的关键成份之一，其品质将直接影响疫苗的免疫效果，因此对于佐剂保存条件和保存期的研究是疫苗产品研发过程中必须开展的工作。本研究在评价常规4度保存佐剂免疫效果的基础上，还同时评价了37度保存2周的佐剂，37度存放通常可作为试剂保存期评价的加速试验，因此也可作为稳定性的参考数据。本研究利用小鼠模型进行免疫评价，具有数据平行性好、经济、操作简便的优点，是佐剂稳定性评价的有效模型。
5. 研究计划与进展
2015.9.12015.9.16：资料搜集、整理，拟订实验方案及实验准备；
2015.9.17：将小鼠分群、标号。
2015.9.18：对小鼠进行第一次免疫。
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