氮素调控水稻茎秆结构性碳水化合物的生理机制开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1、研究意义

前期水稻倒伏的研究发现提高水稻茎秆抗倒伏能力的关键是增强水稻茎秆的机械强度，尤其是基部茎秆的机械强度。提高非结构性碳水化合物(Non-structural carbohydrate, NSC）的积累可以提高茎杆基部节间的机械强度。不过，茎秆中 NSC 更倾向于运输到籽粒中进行灌浆，后期主要靠茎秆中较多的SC来提高茎杆基部节间的机械强度。水稻、小麦的研究均证明，茎秆中高木质素含量积累有利于增强茎秆抗折力。可以认为，水稻茎秆中的 SC 含量对茎秆的机械强度起基础性作用。水稻茎秆的抗倒伏能力受氮素水平影响显著。近年来在水稻和小麦中的研究表明，氮素增加导致了茎秆基部SC含量的显著降低。高氮能够抑制小麦木质素合成相关酶的活性，同时氮素对棉花纤维素关键酶活性也具有调节作用。对水稻愈伤组织的转录组分析发现，亚硝酸盐作用显著下调了肉桂酰 CoA 还原酶基因，降低了木质素含量。然而水稻中氮素对茎秆结构性碳水化合物的调控机理还不清楚，需要系统深入的研究。

2、国内外研究概况

（1）水稻茎秆结构性碳水化合物（Structural carbohydrate, SC）对茎秆机械强度起基础性作用

茎倒伏是水稻生产中的一个普遍问题，也是一个世界性难题^[1]。水稻发生倒伏后，不仅收获费工费时，而且明显降低稻米产量和品质^[2-4]。第一次绿色革命通过降低作物株高，实现了高产和抗倒的双重优化。现代水稻高产育种和栽培强调壮个体、主攻大穗，导致水稻株高有一定程度的增加。因此，协调高产和抗倒伏矛盾，只能通过提高茎秆抗倒伏能力。

提高水稻茎秆倒伏能力主要有两条途径：一是优化基部节间形态结构，包括缩短基部节间长度^[5]、增加茎粗或茎壁厚等^[6-8]；二是提高茎秆的机械强度^{[9, 10]}。这两方面有一定的相关性，但并非同步。我们用同一品种分别云南永胜和江苏丹阳种植，比较发现，相对籽粒产量12 t ha^-1左右的江苏丹阳水稻群体，籽粒产量达18 t ha^-1左右的特高产生态区水稻有效穗多、穗型大、茎秆较纤细，但其倒伏指数小、田间倒伏率低。究其原因是涛源水稻茎秆机械强度大^{[11, 12]}。在江苏丹阳粳稻和籼稻试验中也得到一致的结果（见研究基础）。可见，提高水稻茎秆抗倒伏能力的关键是增强水稻茎秆机械强度。

提高非结构性碳水化合物(Non-structural carbohydrate, NSC）的再积累可以提高茎杆基部节间的机械强度 ^[13-15]。不过，茎秆中NSC更倾向于运输到籽粒中进行灌浆，后期主要靠茎秆中较多的SC来提高茎杆基部节间的机械强度，从而提高抗倒能力^{[11, 12]}。水稻^[16]、小麦^[17]的研究均证明，茎秆中高木质素含量积累有利于增强茎秆抗折力。可以认为，水稻茎秆中的SC含量对茎秆的机械强度起基础性作用。

（2）氮素对茎秆SC有调控作用，其作用机理有待深入研究。

氮是水稻生产投入最多的营养元素，适量增施氮肥可以提高产量，但氮肥过量不仅增加基部节间长度和株高，降低茎粗，而且降低茎秆充实度，导致茎秆强度降低^{[18, 19]}，或者增加病害发生^[20]，从而增加倒伏的风险。前期的研究发现水稻茎秆的抗倒能力受氮肥水平影响显著，这主要是氮素增加导致了茎秆基部SC含量显著降低^{[11, 12, 21]}。这与小麦上的研究结果一致^{[22, 23]}。

氮素如何影响SC的合成？研究者从氮素调节小麦木质素合成相关酶的活性^[23]，以及氮素调节棉花纤维素关键酶活性^[24]，发现了氮素调节相关SC的酶学机制。对水稻愈伤组织的转录组分析发现，亚硝酸盐作用显著下调了肉桂酰CoA还原酶基因，降低了木质素含量^[25]。随着分子技术的进步，近年来发现并克隆了一些参与水稻SC合成相关的基因（表1）。我们初步分析了氮素对部分相关基因表达的影响（见研究基础），其调控机理需要系统深入研究。

表1 近年来发现的与水稻茎秆机械强度相关的基因及其位置与功能

3、应用前景

氮对水稻产量和茎秆抗倒伏能力均有明显影响。水稻茎秆中SC含量对高产水稻群体抗倒起基础性作用。氮素对于水稻茎秆SC的调控作用已经确定，但目前仅局限于氮素水平与SC含量之间的相关分析。分析氮素调控SC形成的生理机制和调控途径，以及在转录组和蛋白质组方面研究氮素对水稻茎秆SC形成分子机制，将极大推进水稻抗倒伏研究的深度；对优化氮肥管理，协调高产与倒伏之间的矛盾也具有非常重要的理论指导意义和实践价值。

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2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标

（1）明确氮素调控水稻茎秆SC形成的关键酶基因；

（2）构建氮素调控水稻茎秆SC合成与分布的分子网络。

3. 研究的方法与方案

1、实验方案

第1组试验：氮素差异调控水稻茎秆SC试验（大田试验）

试验地点：南京农业大学丹阳水稻栽培试验站

试验品种：武育粳23号（抗倒、氮钝感材料）、W3668（不抗倒、氮敏感材料）

氮肥处理：在基、蘖氮肥90kg ha^-1的条件下，设置0 kg ha^-1（低氮）、180kg ha^-1（高氮）的氮素穗肥处理。试验采用随机区组设计。

测定指标：

（1）从基部第2节间开始拔节后至抽穗后20天，每10天对基部第2节间取样，测定纤维素、木质素的含量，同时测定茎顶端和基部节间内源激素含量（生长素和赤霉素）。

（2）抽穗后20天，取长势一致的茎秆，测定茎秆基部节间的机械强度：折断弯矩(gcm)、断面模数(mm³)和弯曲应力(gmm^-2)；同时对基部节间横切面进行扫描电镜观察，比较不同氮素水平下茎秆次生壁发育情况；制作SC的染色切片，观察纤维素和木质素在细胞壁中的分布。

第2组试验：氮素调控水稻茎秆SC合成基因的动态变化试验（桶栽试验）

试验地点以及品种均同试验1。

试验处理：基蘖肥为每桶尿素1.28g(相当于大田90 kg ha^-1)、磷酸二氢钾1.78g、氯化钾0.98g(相当于大田P₂O₅140 kg ha^-1、K₂O186 kg ha^-1)，设置两个氮素穗肥水平0和2.57g/盆(大田180 kg ha^-1)。施用方法：氮素穗肥倒4叶期60%，倒2叶期40%。

试验管理：桶的规格为口径34 cm，底径20 cm，高30 cm，每桶装水稻土15 kg，3穴/桶，1穴2苗，水稻4叶1心期移栽。其他同高产栽培。

测定指标：

从基部第2节间开始拔节后至抽穗后20天，每10天对基部第2节间取样（如图2），测定木质素合成相关基因OsPAL、OsCOMT、Os4CL3、OsCCR1、OsCAD2、OsCAD7的表达和纤维素合成相关基因OsCesA4、OsCesA7、OsCesA9的表达。明确SC合成关键基因的主要表达时间点及其对氮素的响应。

2、技术路线：

3、实验方法

（1）抗倒伏力学指标测定：采用本实验室的实验方法测定^[1]。

（2）SC含量测定：纤维素测定采用Updegraff的方法^[2]，木质素的测定参照Ishimaru的实验方法^[3]。

（3）扫描电镜观察：样品保存在3%的戊二醛溶液中。用Leica振荡切片机切出150nm厚度的茎秆切片，并在日立S-3400N扫描电镜下观察茎秆细胞壁发育情况。

（4）木质素染色切片：样品保存在3%的戊二醛溶液中。用Leica振荡切片机切出100nm厚度的茎秆切片，采用Xiangjun Li的方法^[5]，将切片样品放入1%的间苯三酚溶液中处理10min，再放入18%的盐酸中5min后制片，最后在荧光显微镜下(Zeiss)下进行光学观察。

（5）纤维素染色切片：样品保存在3%的戊二醛溶液中。用Leica振荡切片机切出100nm厚度的茎秆切片，采用Li的方法^[6]，将样品切片放入0.005%的Calcofluor (fluorescent brightener 28;Sigma)水溶液中处理2min后制片，最后在荧光显微镜下(Zeiss)下进行荧光观察。

（6）基因表达测定：使用E.Z.N.A. Plant RNA Kit (Omega Bio-tek, Inc, USA)提取各部位水稻节间RNA；按PrimScript^TM RT reagent Kit (Takara, Kyoto, Japan)说明书进行反转录；使用SYBR Premix Ex Taq^TM(Takara, Kyoto, Japan)试剂盒和Roche 480荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR。测定纤维素合成相关基因^[7] (OsCesA4、 OsCesA7、 OsCesA9)、木质素合成相关基因^[8-11] (OsPAL、OsCOMT、Os4CL3、OsCCR1、OsCAD2、OsCAD7)

表2 荧光定量PCR测定所测定基因的引物序列设计

（7）转录组分析：委托华大基因利用RNA-seq技术进行转录组测序分析。

（8）蛋白质组分析：委托上海博苑生物科技有限公司进行iTRAQ分析。

4、可行性分析：

（1）本项目在水稻高产栽培、氮素生理生态以及分子生物学等方面有坚实的研究基础。在氮素对水稻抗倒能力影响等方面进行了连续多年的研究，明确提高水稻茎秆SC含量是协调水稻高产与倒伏的基础，并初步明确了氮素对水稻茎秆SC影响的基本规律。项目是前期研究的延续和深入，为相关分子机理研究明确了方向。

（2）本项目有遗传与种质创新国家重点实验室、农业部作物生理生态与生产管理实验室等研究平台，拥有配套的设备；项目组成员已熟练掌握相关测定分析方法，有能力完成本项目的研究内容和目标。

4. 研究创新点

（1）以往水稻倒伏的研究集中关注水稻生育后期茎秆物质含量对水稻抗倒伏能力的影响。本项目从水稻节间伸长开始，研究氮素对茎秆SC含量和分布的动态影响，并探索氮素调控SC合成的分子机理。所形成的研究结果将是现有研究成果的重要拓展，是理论创新。

（2）本研究将RNA-seq表达谱以及iTRAQ技术应用到氮素调控水稻茎秆SC代谢的研究，是技术创新。

5. 研究计划与进展

2015.7-2015.10

查阅国内外相关文献，撰写试验计划，并做好田间试验的准备工作。实施第一阶段试验，从基部第2节间开始拔节后至抽穗后20天，桶栽每3天对基部第2节间取样，大田每五天对基部第2节间取样，抽穗后20天研究大田条件下不同氮素穗肥水平下水稻品种茎秆基部节间的机械强度。

2015.10-2015.11

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