1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1本课题意义：
土壤生物学功能的维持很大程度上依赖于土壤微生物生物量及其活性, 土壤微生物是土壤生态系统物质循环的重要基础。大量研究表明, 土壤微生物对农药的降解起着重要作用。同时,农药进入土壤后对土壤微生物生物量及其活性也会产生影响, 进而影响土壤生物学功能。因此, 化学农药进入土壤后对土壤微生物及其活性的影响成为农药生态安全评价的重要指标之一。
土壤质量是农业可持续发展的重要因素, 在以往的研究中, 人们一直强调以土壤理化特性作为持续性指标, 近年来, 关于土壤质量指示生物的研究报道越来越多, 且主要集中在对土壤微生物、土壤植物以及蚯蚓等大型土壤动物上, 其中以土壤微生物研究最多。长期以来, 有关污染物对土壤微生物的研究主要集中在重金属方面, 涉及到农药对土壤微生物群落多样性及功能等方面的研究较少。乙草胺是一种常用除草剂, 关于其对土壤生态系统中微生物种群是否构成潜在威胁却鲜见报道。鉴于此, 本文在大田实验环境条件下, 研究乙草胺对土壤微生物种群的影响, 通过分析土壤微生物对乙草胺污染的响应情况, 探讨土壤微生物作为土壤生态系统污染及可持续性评价指标的可行性, 研究结果对研究生物环境监测、突破常规理化环境监测的局限性有一定参考价值。
2. 研究的基本内容和问题
1研究的目标：
分析2种不同除草剂以及不同用量对稻田土壤微生物种群及酶活性的影响。
2内容：
3. 研究的方法与方案
1研究方法：
调查法、文献研究法、实验法
2技术路线：
细菌培养基，采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。细菌培养基，采用牛肉膏蛋白胨培养基。该培养基的组成如下: 牛肉膏3．0g; 水1 000mL; 蛋白胨10．0g;Nacl 5.0g; 琼脂20．0g;
pH 7．0～ 7．2。121℃高压灭菌20～30 min，冰箱保存。称取10g土壤样品，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上室温振荡20min，使土样与水充分混合，将土壤中的微生物细胞充分分散，从土壤中分离出来。此为10-1土壤悬液，吸取lml此土壤悬液于9ml无菌水中，另用无菌吸管吹吸3次混匀，制成10-2土壤悬液。以此类推依次制成10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤悬液。在培养箱培养24小时后计数。
真菌培养基，采用马丁氏培养基。该培养基组成如下: KH2PO4 1．0g; 葡萄糖10．0g; MgSO47H2O 0.5g; 琼脂20．0g; 蛋白胨5．0g;水1 000mL; 此培养液1 000mL 加1% 孟加拉红水溶液3．3mL。临用时每100mL 培养基中加1% 链霉素液0．3mL( 30mg /kg)。pH 6．8～ 7．0,115℃高压灭菌20～30 min. 称取10g土壤样品，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上室温振荡20min，使土样与水充分混合，将土壤中的微生物细胞充分分散，从土壤中分离出来。此为10-1土壤悬液，吸取lml此土壤悬液于9ml无菌水中，另用无菌吸管吹吸3次混匀，制成10-2土壤悬液。以此类推依次制成10-2、10-3、10-4不同稀释度的土壤悬液。在培养箱培养3-5天后计数。
放线菌培养基，采用改良高氏1号培养基。该培养基的组成如下: KNO3 1．0g; FeSO47H2O 0．01g; K2HPO4 0．5g; 可溶性淀粉20．0g; MgSO47H2O 0．5g; NaCl 0．5g; 琼脂20．0g; 水1 000 mL。pH 7．2～ 7．4. 121℃高压灭菌20～30 min.临用时在已融化的培养基中加入重铬酸钾溶液抑制真菌和细菌的生长，每300mL 培养基中加3% 重铬酸钾1mL( 100mg /kg)。称取10g土壤样品，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上室温振荡20min，使土样与水充分混合，将土壤中的微生物细胞充分分散，从土壤中分离出来。此为10-1土壤悬液，吸取lml此土壤悬液于9ml无菌水中，另用无菌吸管吹吸3次混匀，制成10-2土壤悬液。以此类推依次制成10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤悬液。在培养箱培养5-7天后计数。
过氧化氢酶（CAT）测定方法 取2g过1mm（20目）的土样，置于100mL塑料三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%过氧化氢溶液。将三角瓶放在复式振荡机上，振荡20min。而后加入5mL 3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速型滤纸（致密滤纸）过滤。然后，吸取25mL滤液，用0.IN高锰酸钾滴定至淡粉红色（微红色）终点，记录消耗高锰酸钾的毫升数（V1），并且设置无土基质对照（即不加土样，其他操作与样品试验相同），对照消耗高锰酸钾的毫升数即为（V2）土壤过氧化酶活性的计算公式：M=（V2-V1）T/g
土壤脲酶活性的测定方法：
1) 称取5g过1mm筛的风干土样于50ml容量瓶中。2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并 仔细混合4) 将容量瓶放入38摄氏度恒温箱中，培养3h溶液呈现（青定）酚的蓝色。5) 培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。6) 显色：吸取1ml滤液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸馏水，充分震荡，然后加入4ml苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度。
7) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。8) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照9)无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照
土壤蔗糖酶测定（比色法）
称取2.0 g新鲜土，置于50ml三角瓶中，注入15ml 8％蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲液和0.25ml甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量量瓶中，加3ml 3，5-二硝基水杨酸，并在沸水的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质（无蔗糖）对照，整个试验需做无土壤对照。
3实验方案：
除草剂试验方案
试验目的：分析2种不同除草剂以及不同用量对稻田土壤微生物种群及酶活性的影响。
防治对象和供试作物：当地常见杂草；水稻。
试验材料：丁草胺和华星草克除草剂。
试验设计：
本试验在江苏省南京市江宁区淳化镇试验田进行，试验以丁草胺和华星草克两个稻田常用化学除草剂为试验药剂，同时设置不用除草剂为对照，两种除草剂分别设置不同浓度的处理。在水稻移栽后4~6d对其喷洒，分别在1、4、7、15、30取样分析有关参数，分析不同除草剂以及不同剂量对水稻土壤微生物数量及酶活性的影响。
稻田以丁草胺和华星草克为试验药剂,共7个处理,3次重复:
(1)对照(不用除草剂); (2)丁草胺药剂低量处理; (3)丁草胺药剂常量处理; (4)丁草胺药剂加量处理,(5)华星草克药剂低量处理; (6) 华星草克药剂常量处理(7)华星草克药剂加量处理
药剂名称和浓度：
华星草克（20%苄乙可湿性粉剂）：本品是两种有效成分的复制配剂（乙草胺和苄嘧磺隆），为选择性芽前除草剂。能有效防除水稻移栽田一年生及部分多年生部分杂草，牛繁缕、播娘蒿、荠菜、大巢菜、鲤肠、猪殃殃、野荸荠、牛毛毡、异型莎草、鸭舌草、野慈菇、四叶萍等一年生阔叶杂草及莎草科杂草。
丁草胺：丁草胺为酰胺类选择性内吸传导除草剂。纯品为淡黄色油状液体，具有微芳香味。难溶于水，易溶于多种有机溶剂。在常温及中性、弱碱性条件下化学性质稳定。强酸条件下会加速其分解，在土壤中可被降解。对人畜低毒，对皮肤、眼睛有刺激作用，对鱼类高毒。丁草胺主要通过杂草的幼芽吸收，而后传导全株而起作用。芽前和苗期均可使用。植物吸收丁草胺后，在体内抑制和破坏蛋白酶，影响蛋白质的形成，抑制杂草幼芽和幼根正常生长发育，从而使杂草死亡。在粘壤土及有机质含量较高的土壤上使用，药剂可被土壤胶体吸收，不易被淋溶，特效期可达1-2个月。
药剂名称及浓度如下图所示：
编号 | A | B | C | D | E | F | CK |
药剂 | 华星草克 | 丁草胺 | |||||
浓度 | 225 g/hm2 | 450 g/hm2 | 675 g/hm2 | 1200 ml/hm2 | 1500ml/hm2 | 1800 ml/hm2 | 0 |
小区示意图：
水渠 | ||||||||||||||
保护行 | 保护行 | 沟
梗 | 保护行 | |||||||||||
D | CK | B | F | A | E | C | ||||||||
A | F | C | CK | E | B | D | ||||||||
F | E | A | D | C | CK | B | ||||||||
水渠 |
小区设计：共7个处理（包括1个对照），3次重复，共21个小区。各小区随机排列，每个小区面积为3*7=21m2，共21个小区；保护行宽2.5m，沟加梗宽90cm（沟宽30cm,梗宽30cm），试验田总共面积约816m2。
测定项目与方法
（1）可培养微生物量 可培养微生物总数测定采用平板涂布法
细菌的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基,
真菌为马丁培养基,
放线菌为高氏1号培养基。
（2）土壤酶活性
蔗糖酶活性测定采用3, 5-二硝基水杨酸比色法;
脲酶活性测定采用尿素残留法;
过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法。
4可行性分析:
我们课题组主要从事农业生态的研究，前期对土壤酶活性有过大量的研究，具有较好的基础。 我们联系了从事微生物研究的教师和江苏农科院对农药剂量施用的指导。国内对除草剂研究成果较多，对我们课题的研究提供了丰富的基础性支撑。我们收集到了比较多的相关文献和书籍等。
4. 研究创新点
在以往的研究中, 人们一直强调以土壤理化特性作为持续性指标, 近年来, 关于土壤质量指示生物的研究报道越来越多, 且主要集中在对土壤微生物、土壤植物以及蚯蚓等大型土壤动物上, 其中以土壤微生物研究最多。
长期以来, 有关污染物对土壤微生物的研究主要集中在重金属方面, 涉及到农药对土壤微生物群落多样性及功能等方面的研究较少。
乙草胺是一种常用除草剂, 关于其对土壤生态系统中微生物种群是否构成潜在威胁却鲜见报道。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2012年3至 10月间对江苏地区的苏州、扬州、南京等城市的常用农药投入情况进行了问卷调查和采访，了解当地土质和杂草种类，确定实验除草剂的品种。
2013年7月初江宁布置实验小区，7月六号水稻移栽，12号取基础土样和施除草剂，计划在1、4、7、15、21、30d，即7月13、19、26号及8月2、11号取土样。
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