1. 研究目的与意义
血栓形成是多因素参与、渐进发展的复杂过程，血液在流动状态下因血小板的活化和凝血因子被激活而发生的异常凝固。动脉血栓形成初期主要由血管内皮受损，血小板黏附和聚集所致，而静脉血栓一般由血流缓慢或瘀滞引起。动物模型常被用来了解病理过程包括血栓的形成机制以及抗血栓药物的有效性和安全性评价。斑马鱼作为一种研究人类疾病理想的新型模式动物，具有许多独特的优势，如斑马鱼与人类一样具有遗传保守性，存在70%的人类同源基因，以及拥有凝血因子、血小板受体，并对临床应用的抗凝血和抗血栓药物具有很好的反应，适合于血栓形成机制和治疗药物的评价。近来有学者研究认为，活血化瘀是中医抗血栓的治则。 茜草炭具有化瘀止血的功效，本课题复制活体斑马鱼血栓模型，并观察茜草炭抗血栓的作用，为茜草炭化瘀作用机制的深入研究提供参考。
血管新生与中医学生脉理论密切相关，中医文献中有生脉、生肌等方面的论述，以及瘀血不去，新血不生瘀去则络生理论，这为中医药促血管新生作用奠定了理论基础。已有研究表明，化瘀类中药具有一定的促进血管新生的作用，其主要作用机制很可能是通过上调VEGF受体基因表达，保护血管内皮细胞。本实验创造性地利用VRI（血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂II）诱导Tg(fli-1:EGFP)y1转基因斑马鱼（血管内皮细胞被标记绿色荧光）血管缺损模型对茜草及茜草炭的促血管新生活性进行研究，评价其对血管内皮细胞的保护作用。
2. 文献综述
茜草炭的研究进展
黄 露
（南京中医药大学药学院，江苏南京，210046）
3. 设计方案和技术路线
研究方案：
1、斑马鱼血栓和血管损伤模型建立与药物干预
血栓模型：AB系斑马鱼胚胎发育至 2 d 时，在解剖显微镜挑选发育正常的胚胎，将其分到微孔板中，设置 8 个实验组: 即正常对照组( NC) 、模型组( 用 1. 5 μmol/L 苯肼处理，PH model) 、茜草炭干预组: 诱导剂 1. 5 μmol/L 苯肼处理24h后，移除后并清洗，分别加入终浓度为 12. 5、25、50、100 和 200 mg /L 的茜草炭处理24h; 阿司匹林组: 诱导剂 1. 5 μmol/L 苯肼处理24h后，加入终浓度 5.625 mg /L 阿司匹林处理24h。每组 30 尾，之后 28℃ 恒温培养箱培养 24 h。
血管损伤模型：选择状态良好，发育至 24 h 的斑马鱼胚胎，除去卵壳，将其放入饲养 液 的 24 孔 板 中 ( 每 孔 不 少 于10 个) 。预先加入
VRI 500 ng / ml，在饲养箱里处理3 h，然后用饲养液清洗 3 ～ 4 遍，再加入用 少量DMSO 溶解的 6.25、12.5、25、50、100 μg /ml 的茜草炭，以 0.1%的 DMSO 为空白对照，加入VRI后加 0.1% DMSO组为阴性对照，放入 28． 5 ℃的饲养箱里。饲养至约24h 时，在荧光显微镜下观察茜草炭在不同浓度对斑马鱼节间血管( ISVs)的影响。
2、观察与记录
血栓模型：经诱导剂处理后，用 1 g /L 邻联茴香胺染液对斑马鱼染色 30 min; 然后，每组随机挑选 20 尾斑马鱼在显微镜下观察尾静脉血栓情况并拍照，照片拍摄放大倍数为 56 倍; 用 NIS-Elements DTM图像处理软件进行定量分析心脏红细胞染色强度( SI) ，并计算治疗血栓药效 ( % ) =［SI( 药物干预组) -SI( 模型组) ］/SI( 正常对照组) -SI( 模型组) 100% 和EC50
血管损伤模型：从背主动脉( DA) 或者脊椎主静脉( PCV) 发芽延伸并连
接到背部脊索血管( DLAVs) 的 ISVs 定义为完整血管( intact) ，而一些已经从 DA 或者 PCV 延伸出，但是并无与 DLAVs 相连的 ISVs 定义为缺陷型血管( defective) 。分别对每条斑马鱼的完整型和缺陷型血管进行统计分析。
3、结果与分析
将不同浓度茜草炭实验组与正常组、模型组、阳性药物组进行对比。得出结论。
技术路线流程图： |
4. 工作计划
时 间 | 研究内容 | 完成情况 |
2022-03 | 茜草炭样品的制备 | 正在进行中 |
2022-03 | 斑马鱼血栓模型的建立与茜草炭的干预 | 正在进行中 |
2022-04 | 斑马鱼血管缺损模型的建立与茜草炭的干预 | 未完成 |
2022-05 | 分析和整理数据，文献研究，撰写毕业论文，准备答辩。 | 未完成 |
5. 难点与创新点
之前研究抗血栓和促进血管再生都常用大鼠、小鼠，但是本课题采用斑马鱼。因为斑马鱼与人类一样具有遗传保守性，存在70%的人类同源基因，以及拥有凝血因子、血小板受体，并对临床应用的抗凝血和抗血栓药物具有很好的反应，适合于血栓形成机制和治疗药物的评价。
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